突破傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率極限，千眼狼sCMOS相機實現(xiàn)SIM超分辨顯微技術(shù)的高速與高分辨率成像

   1、實驗背景

   細(xì)胞是生命科學(xué)領(lǐng)域基本功能單元，解析亞細(xì)胞器及細(xì)胞骨架等精細(xì)結(jié)構(gòu)是研究重點。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡受制于衍射極限，難以清晰呈現(xiàn)100nm尺度的細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)光照明顯微是一種寬場超分辨成像技術(shù)，通過空間調(diào)制照明與頻域重建算法，可將橫向分辨率提升至~100nm，成為細(xì)胞超分辨率成像新路徑。

   SIM需在極低光毒性條件下實現(xiàn)活細(xì)胞高速動態(tài)成像，故對成像系統(tǒng)靈敏度、噪聲控制、時間分辨率要求極高，某課題組采用中科君達(dá)視界自研的千眼狼sCMOS相機Gloria 4.2，量子效率高達(dá)95%，開展對生物細(xì)胞骨架的超分辨動態(tài)成像實驗。

   2、實驗?zāi)繕?biāo)

   I. 評估sCMOS相機在SIM超分辨顯微鏡中對百納米尺度細(xì)胞樣本的成像能力。

   II.評估sCMOS相機在低曝光（低光毒性要求）時間下的信噪比表現(xiàn)。

   3、實驗方法

   實驗使用倒置熒光顯微鏡，集成SIM超分辨成像模塊。樣本為熒光標(biāo)記的細(xì)胞骨架，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)制備后固定于載物臺上。圖像探測采用千眼狼Gloria 4.2 sCMOS相機，設(shè)置ROI分辨率為960×368，Binning模式2×2（提升靈敏度），曝光時間10 ms，幀率100 fps，使用外觸發(fā)同步，讀出模式選用CMS低噪聲模式，以優(yōu)化圖像信噪比。

   4、實驗數(shù)據(jù)解析

   4.1成像性能解析：

   10 ms曝光條件下，千眼狼Gloria 4.2相機可實現(xiàn)100 fps幀率采集，優(yōu)于同條件下EMCCD相機，后者僅支持10 ms內(nèi)30 fps采集幀率，圖像數(shù)據(jù)獲取效率較低。

   4.2 圖像質(zhì)量解析：

   · 單幀圖像：10 ms曝光下，sCMOS相機捕捉的圖像計算重構(gòu)后可呈現(xiàn)細(xì)胞骨架的輪廓微絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖1），纖維走向、分支結(jié)構(gòu)等特征初步可辨識，清晰可見微管纖維的局部交叉點且無拖影現(xiàn)象，證明低光強下?lián)碛?5%高QE、100 fps采集幀率的sCMOS相機可有效捕獲微弱熒光信號。

圖1

   · 合成圖像：經(jīng)SIM算法重建后，合成圖像分辨率達(dá)到約100 nm，突破衍射極限，使得微管纖維的分支點、交叉形態(tài)清晰可辨，且憑借Gloria 4.2相機高動態(tài)范圍（16 bit），合成圖像在弱信號區(qū)域（如細(xì)胞基質(zhì)）與強信號區(qū)域（熒光團(tuán)聚集處）均表現(xiàn)出良好的線性響應(yīng)與細(xì)節(jié)保留能力，未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。

圖2

   本次實驗成功將高量子效率 95%的sCMOS相機 Gloria 4.2集成于SIM超分辨顯微系統(tǒng)，實現(xiàn)了在100 fps下對細(xì)胞樣本的百納米級分辨率成像。實驗結(jié)果表明，中科君達(dá)視界自研的千眼狼sCMOS相機適用于低光毒性、低噪聲、高速的生命科學(xué)領(lǐng)域圖像探測任務(wù)。